Can't call method "isa" on unblessed reference at C:/Perl/site/lib/Bio/Tools/Run/Alignment/Clustalw.pm line 85

**Jasmine80** · 08/04/2011, 09h33

Appel du sous-programme

Code :

Sélectionner tout - Visualiser dans une fenêtre à part

&ClustalW2 ($out_file, \($seq->seq, $sequences_ref{$gene}) );

Code :

Sélectionner tout - Visualiser dans une fenêtre à part

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sub ClustalW2 {
 
	my $fich_fsa = $_[0];
	my $seq_array_ref = $_[1];
 
 
	(my $fich_msf) = $fich_fsa =~ s/\.fsa/\.msf/;
 
 
	# my $fich_msf_fh = FileHandle->new (">".$fich_msf);
	# close $fich_msf_fh;
 
	my @params = (	
 
		'gapopen' => 15,
		'PAIRGAP' => 0,
		'ktuple' => 4, 
		'type' => 'dna', 
		'outfile' => $fich_msf, 
		'format' => 'Fasta',
		'outorder' => 'aligned',
	);
 
	# and pass the factory a reference to that array
	my $factory = Bio::Tools::Run::Alignment::Clustalw->new(@params);
	$factory->executable("C:/ClustalW2/clustalw2.exe");
	# $factory->executable("C:/ClustalW/clustalw.exe");
 
	my $aln = $factory->align($seq_array_ref);
 
	# création du fichier fasta
	my $in_msf  = Bio::AlignIO->new(-file => $fich_msf , -format => 'msf');
	my $out_fsa = Bio::AlignIO->new(-file => ">".$fich_fsa , -format => 'fasta');
 
	while ( my $aln = $in_msf->next_aln() ) {
	    $out_fsa->write_aln($aln);
	}
}

ERREUR

Can't call method "isa" on unblessed reference at C:/Perl/site/lib/Bio/Tools/Run/Alignment/Clustalw.pm line 854, <GEN0> line 1.

Merci pour votre aide

**Dimitry.e** · 08/04/2011, 10h00

Où est la ligne 854 ?

**Jasmine80** · 08/04/2011, 10h04

Envoyé par Dimitry.e

Où est la ligne 854 ?

Il n'y en a pas ... ça doit-être dans le module

**Philou67430** · 08/04/2011, 10h16

Il y a de fortes chance que lors de la création de ton objet $factory, les paramètres fournis n'ont pas permis la création et qu'une méthode interne a échouée.
Pour connaitre la fonction de ton programme qui a engendré l'erreur tu peux lancer ton script ainsi :

Code :

Sélectionner tout - Visualiser dans une fenêtre à part

perl -MCarp=verbose script.pl ...

(ou bien ajoute

Code :

Sélectionner tout - Visualiser dans une fenêtre à part

$Carp::verbose = 1;

au début de ton script).

Si cela ne donne pas plus d'indication, tente alors d'ajouter ceci :

Code :

Sélectionner tout - Visualiser dans une fenêtre à part

$SIG{__DIE__} = sub { require Carp; Carp::confess };

**Jasmine80** · 08/04/2011, 10h22

Merci Philou

J'obtiens :

Name "Carp::verbose" used only once: possible typo at Bio_SeqIO_ref_compare.pl line 6.
Can't call method "isa" on unblessed reference at C:/Perl/site/lib/Bio/Tools/Run/Alignment/Clustalw.pm line 854, <GEN0> line 1.

at Bio_SeqIO_ref_compare.pl line 6
main::__ANON__('Can\'t call method "isa" on unblessed reference at C:/Perl/si...') called at C:/Perl/site/lib/Bio/Tools/Run/Alignment/Clustalw.pm line 854
Bio::Tools::Run::Alignment::Clustalw::_setinput('Bio::Tools::Run::Alignment::Clustalw=HASH(0x22745fc)', 'SCALAR(0x213ba68)') called at C:/Perl/site/lib/Bio/Tools/Run/Alignment/Clustalw.pm line 508
Bio::Tools::Run::Alignment::Clustalw::align('Bio::Tools::Run::Alignment::Clustalw=HASH(0x22745fc)', 'SCALAR(0x213ba68)') called at Bio_SeqIO_ref_compare.pl line 110
main::ClustalW2('FileHandle=GLOB(0x1f74a84)', 'SCALAR(0x213ba68)', 'SCALAR(0x236c04)') called at Bio_SeqIO_ref_compare.pl line 73

**Jasmine80** · 08/04/2011, 10h25

Si j'utilise les paramètres de la doc :

Code :

Sélectionner tout - Visualiser dans une fenêtre à part

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	my @params = ('ktuple' => 2, 'matrix' => 'BLOSUM');
	my $factory = Bio::Tools::Run::Alignment::Clustalw->new(@params);
 
	$factory->executable("C:/ClustalW2/clustalw2.exe");

J'obtiens la même erreur

**Philou67430** · 08/04/2011, 11h57

Il semble que ce soit la ligne 73 de ton script Bio_SeqIO_ref_compare.pl qui soit à l'origine de l'exception dans le module qui reporte l'erreur.
Difficile d'en dire plus, il faudrait sans doute pouvoir prendre la main sous le debugger.

**Jasmine80** · 08/04/2011, 12h00

Envoyé par Philou67430

Il semble que ce soit la ligne 73 de ton script Bio_SeqIO_ref_compare.pl qui soit à l'origine de l'exception dans le module qui reporte l'erreur.
Difficile d'en dire plus, il faudrait sans doute pouvoir prendre la main sous le debugger.

Code :

Sélectionner tout - Visualiser dans une fenêtre à part

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	else {
		my $out_file = FileHandle->new ('>P:/Theorie/YANN/Fadoua/mutation_seq/ref_ali/'.$seq->primary_id.'_ref.txt');
		&ClustalW2 ($out_file, \($seq->seq, $sequences_ref{$gene}) );
	}	
 
	print $sequences_ref{$gene}."\n";

La ligne 73, c'est un espace mais la 71 &ClustalW2 ($out_file, \($seq->seq, $sequences_ref{$gene}) );

Merci beaucoup pour ton aide, je vais continuer de chercher, je finirai bien par trouver.

**Philou67430** · 08/04/2011, 12h05

Le deuxième paramètre de l'appel à ClustalW2 me semble assez étrange. Il s'agit de la référence d'une liste (donc, apriori, la liste des références de chaque élément de la liste).

N'aurais-tu pas voulu écrire :

Code :

Sélectionner tout - Visualiser dans une fenêtre à part

		&ClustalW2 ($out_file, [ $seq->seq, $sequences_ref{$gene}] );

(je précise que je n'ai pas vérifier le prototype de ClustalW2).

**Jasmine80** · 08/04/2011, 12h12

Voici, un script qui fonctionne

Code :

Sélectionner tout - Visualiser dans une fenêtre à part

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		my @params = (	
 
			'gapopen' => 15,
			'ktuple' => 4, 
			'type' => 'dna', 
			'outfile' => $fich_msf, 
			'format' => 'Fasta',
			'outorder' => 'aligned',
		);
 
		# Bio::Perl : reads an array of sequences
		my @seq_array = read_all_sequences($file,'fasta');
 
		# and pass the factory a reference to that array
		my $seq_array_ref = \@seq_array;
		my $factory = Bio::Tools::Run::Alignment::Clustalw->new(@params);
		$factory->executable("C:/ClustalW2/clustalw2.exe");
		# $factory->executable("C:/ClustalW/clustalw.exe");
 
		my $aln = $factory->align($seq_array_ref);
 
		# création du fichier fasta
		my $in_msf  = Bio::AlignIO->new(-file => $fich_msf , -format => 'msf');
		my $out_fsa = Bio::AlignIO->new(-file => ">".$fich_fsa , -format => 'fasta');
 
		while ( my $aln = $in_msf->next_aln() ) {
		    $out_fsa->write_aln($aln);
		}

@seq_array contient une liste de séquences. J'aimerais qu'elle contienne mes deux séquences qui ne proviennent pas d'un fichier.

Avec

Code :

Sélectionner tout - Visualiser dans une fenêtre à part

&ClustalW2 ($out_file, [ $seq->seq, $sequences_ref{$gene}]  );

J'obtiens :

MSG: Bad input data (sequences need an id ) or less than 2 sequences in ARRAY(0x228795c)

Probablement parcequ'il faut passer deux objets de séquences et non deux séquences. Je vais regarder de ce côté là.

**Jasmine80** · 08/04/2011, 12h14

oui, c'est bien ça : de la doc

# where @seq_array is an array of Bio::Seq objects
$aln = $factory->align($seq_array_ref);

**Jasmine80** · 08/04/2011, 12h24

Code :

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#!/usr/bin/perl
 
 
use strict;
use warnings;
 
use Bio::SeqIO;
use Bio::Tools::Run::Alignment::Clustalw;
use FileHandle;
 
 
 
my $file = 'P:/Theorie/YANN/Fadoua/mutation_seq/all_contigs.txt';
my $in  = Bio::SeqIO->new(-file => $file , '-format' => 'fasta');
 
# GAG = E104	CTG = R164	GGT = G238
my $TEM_ref = 'AACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCC';
 
# AGC = S130	GAC = D179	GGC = G238	GAG ou GAA = E240
my $SHV_ref = 'TCTGTGCCGCCGTCATTACCATGAGCGATAACAGCGCCGCCAATCTGCTGCTGGCCACCGTCGGCGGCCCCGCAGGATTGACTGCCTTTTTGCGCCAGATCGACGACAACGTCACCCGCCTTGACCGCTGGGAAACGGAACTGAATGAGGCGCTTCCCGGCGACGCCCGCGACACCACTACCCCGGCCAGCATGGCCGCGACCCTGCGCAAGCTGCTGACCAGCCAGCGTCTGAGCGCCCGTTCGCAACGGCAGCTGCTGCAGTGGATGGTGGACGATCGGGTCGCCGGACCGTTGATCCGCTCCGTGCTGCCGGCGGGCTGGTTTATCGCCGATAAGACCGGAGCTGGCGAGCGGGGTGCGCGCGGGATTGTCGCCCTGCTTGGCCCGAATAACAAAG';
 
 
=h
CTX-1	CTX-2	Pyro
Subgroup CTX-M
AAAAAATCTGACCTGG	GGTGACTATGGCA	1A
AAAAAATCTGACCTGG	GGTGGCTATGGCA	1B
AAAAAATCTGACCTTG	GGTGGCTATGGCA	1C
AAAAAATCTGACCTTG	GGTGACTATGGCA	1D
AAAAAATCTGACTTGG	GGTGACTATGGCA	1E
AAAAAATCTGACCTGG	GGTGACTATGGTA	1F
AAAAAATCTGACCTGG	GGTGGCTATGGTA	1G
AAAAAATCTGACCTGG	TGTGACTATGGTA	1H
AAGAAGAGCGACCTGG	GGAGATTATGGCA	2A
AGAGCAAGCGACCTGG	GGAGATTATGGCA	2B
AAGGCGAGCGACCTGG	GGAGATTATGGCA	2C
AAGCCTGCCGATCTGG	GGCGGCTACGGCA	9A
AAGCCTGCCGATCTGG	GGCGACTACGGCA	9B
AAATCCTCGGACCTGA	GGTGATTATGGTA	8A
AAATCTTCAGACCTGA	GGTGATTATGGTA	8B
AAGCCCTCAGACTTGA	GGCGGTTATGGTA	25A
AAGCCCTCAGACTTGA	GGCGATTATGGTA	25B
AAGCCCTCAGACTTGG	GGCGGTTATGGTA	25C
=cut
 
my $CTX1_ref = 'ATGTGCAGCACCAGTAAAGTGATGGCCGTGGCCGCGGTGCTGAAGAAAAGTGAAAGCGAACCGAATCTGTTAAATCAGCGAGTTGAGATCAAAAAATCTGACTTGGTTAACTATAATCCGATTGCGGAAAAGCACGTCGATGGGACGATGTCACTGGCTGAGCTTAGCGCGGCCGCGCTACAGTACAGCGATAACGTGGCGATGAATAAGCTGATTTCTCA';
my $CTX2_ref = 'TGGTGACATGGATGAAAGGCAATACCACCGGTGCAGCGAGCATTCAGGCTGGACTGCCTGCTTCCTGGGTTGTGGGGGATAAAACCGGCAGCGGTGACTATGGCACCACCAACGATATCGCGGTGATCTGGCCAAAAGATCGTGCGCCGCTGATTCTGGTCACTTACTTCACCCA';
 
my %sequences_ref = (
 
	TEM => $TEM_ref,
	SHV => $SHV_ref,
	'CTX-1' => $CTX1_ref,
	'CTX-2' => $CTX2_ref,
 
);
 
while ( my $seq = $in->next_seq() ) {
 
	my ($gene, $bact) = $seq->primary_id =~ m/([A-Z\d-]+)_(\w+)/i;
 
 
	# on aligne le contig à notre séquence de référence
 
	if (! exists $sequences_ref{$gene}){
		print "PROBLEME DE REFERENCE POUR $gene\t$bact\n";
	}
 
	else {
 
		my $seqobj_ref = Bio::Seq->new( -display_id => $gene.'_ref',
						-seq => $sequences_ref{$gene});
 
		&ClustalW2 ([ $seq, $seqobj_ref], $seq->primary_id );
	}	
 
	print $sequences_ref{$gene}."\n";
 
}
 
 
 
sub ClustalW2 {
 
	my $seq_array_ref = $_[0];
	my $id = $_[1];
 
	my $fich_fsa = '>P:/Theorie/YANN/Fadoua/mutation_seq/ref_ali/'.$id.'.fsa';
	my $fich_msf = '>P:/Theorie/YANN/Fadoua/mutation_seq/ref_ali/'.$id.'.msf';
 
 
	my @params = (	
 
		'gapopen' => 15,
		'PAIRGAP' => 0,
		'ktuple' => 4, 
		'type' => 'dna', 
		'outfile' => $fich_msf, 
		'format' => 'Fasta',
		'outorder' => 'aligned',
	);
 
	# and pass the factory a reference to that array
	my $factory = Bio::Tools::Run::Alignment::Clustalw->new(@params);
	$factory->executable("C:/ClustalW2/clustalw2.exe");
 
 
	my $aln = $factory->align($seq_array_ref);
 
	# création du fichier fasta
	my $in_msf  = Bio::AlignIO->new(-file => $fich_msf , -format => 'msf');
	my $out_fsa = Bio::AlignIO->new(-file => ">".$fich_fsa , -format => 'fasta');
 
	while ( $aln = $in_msf->next_aln() ) {
	    $out_fsa->write_aln($aln);
	}
}

Voila, j'ai une autre erreur.

------------- EXCEPTION -------------
MSG: ClustalW call (C:/ClustalW2/clustalw2.exe align -infile=D:\DOCUME~1\Minguet\LOCALS~1\Temp\KrCks9W6pi\1LjSFiqE7h -output=gcg -outfile=>P:/Theorie/YANN/Fadoua/mutation_seq/ref_ali/SHV_souche_A.msf -outorder=aligned -ktuple=4 -type=dna -pairgap=0 -gapopen=15 2>&1) crashed: 256
STACK Bio::Tools::Run::Alignment::Clustalw::_run C:/Perl/site/lib/Bio/Tools/Run/Alignment/Clustalw.pm:767
STACK Bio::Tools::Run::Alignment::Clustalw::align C:/Perl/site/lib/Bio/Tools/Run/Alignment/Clustalw.pm:515
STACK main::ClustalW2 Bio_SeqIO_ref_compare.pl:108
STACK toplevel Bio_SeqIO_ref_compare.pl:74
-------------------------------------

**Jasmine80** · 08/04/2011, 14h53

le problème venait du fichier de sortie

Code :

Sélectionner tout - Visualiser dans une fenêtre à part

'outfile' => $fich_msf,

**Philou67430** · 09/04/2011, 21h32

J'avais visé juste dans ma première réponse

**Jasmine80** · 14/04/2011, 11h48

Coucou,

je viens de reprendre le programme, et j'ai immédiatement trouvé l'erreur. Comme quoi, quand on est trop dedans, on ne voit plus ses fautes.

Code :

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	my $fich_fsa = '>P:/Theorie/YANN/Fadoua/mutation_seq/ref_ali/'.$id.'.fsa';
	my $fich_msf = '>P:/Theorie/YANN/Fadoua/mutation_seq/ref_ali/'.$id.'.msf';
 
 
 
# plus bas
 
my $out_fsa = Bio::AlignIO->new(-file => ">".$fich_fsa , -format => 'fasta');

=> j'ai donc deux fois le '>' d'ouverture

... comme quoi, une bête erreur peut nous tracasser longtemps !

Can't call method "isa" on unblessed reference at C:/Perl/site/lib/Bio/Tools/Run/Alignment/Clustalw.pm line 85

Langage Perl

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